Diagnostyka mykologiczna

Na czym polega diagnostyka mykologiczna, jakie metody wykorzystuje się wykonując badanie mykologiczne? Dokładny opis stosowanych technik znajdziecie Państwo poniżej:

1.Wstępna ocena ogniska chorobowego:

Przed pobraniem materiału do badania mykologicznego pomocna jest ocena ognisk chorobowych w świetle lampy Wooda. Jest to przenośna lampa kwarcowa, w której dzięki zastosowaniu specjalnego czarnego filtra, (filtr Wooda zbudowany z krzemianu baru z dodatkiem 9% tlenku niklu, którego pasmo przepustowości wynosi od 320 do 400 nm z maksimum w 365 nm), emitowane jest długofalowe promieniowanie nadfioletowe. Promieniowanie to 'bombarduje’ komórki grzyba i w efekcie zaczynają one silnie fluoryzować w świetle lampy. Pozwala to na wstępne rozpoznanie pewnych typów zakażenia grzybiczego. Grzybica drobnozarodnikowa wywołana przez Microsporum canis daje w świetle lampy Wooda charakterystyczną, zielonkawą fluorescencję, natomiast łupież pstry wywołany przez Malassezia furfur charakteryzuje się żółto-białą fluorescencją.

2.Konwencjonalna diagnostyka zakażeń grzybiczych:

Na tradycyjne badanie mykologiczne składa się badanie bezpośrednie, badanie hodowlane oraz dodatkowe testy fizjologiczne i biochemiczne.

Badanie bezpośrednie: Polega na wykrywaniu elementów struktury grzyba (nici, zarodniki) w materiale pobranym od pacjenta (łuski skórne, włosy, paznokcie). Materiał ten poddaje się działaniu roztworu rozjaśniającego: 10-20% wodorotlenku potasu (KOH) z dodatkiem 40% dimetylosulfotlenku (DMSO) i ogląda się w mikroskopie, w powiększeniu 400x. Preparaty do badań bezpośrednich można wybarwiać także atramentem Parkera, oranżem akrydyny, czy fluorochromami. Ważne jest to, iż badaniem tym nie można wykluczyć grzybicy, można ją jedynie potwierdzić. Badanie bezpośrednie może być fałszywie ujemne, zwłaszcza, jeżeli preparat jest zbyt gruby, nie został poddany wystarczająco długo działaniu roztworu rozjaśniającego, czy też nie został obejrzany przez osobę wyspecjalizowaną w tej dziedzinie.

Badanie hodowlane: Z pozostałej części materiału pobranego do badania zakładana jest hodowla, najczęściej na podłożu Sabourauda. Grzyby patogenne są anaerobami, z tego względu też ich hodowlę należy prowadzić w probówkach z korkami ligninowymi, bądź metalowymi zakrętkami, przy uprzednim upewnieniu się, iż nie są one szczelnie zakręcone. Niektóre gatunki grzybów są bardzo wrażliwe na brak tlenu – w warunkach beztlenowych hodowla szybko ginie. Ważne są również warunki prowadzenia hodowli, takie jak temperatura. Przykładowo, dla dermatofitów optimum temperatury waha się w granicach 25^oC – 37^oC (obecnie przyjmuje się, iż najlepsza temperatura dla ich wzrostu i rozwoju to 26^oC), co odpowiada temperaturze powierzchni skóry, która, jak wiadomo, utrzymuje się w granicach 30^oC – 34^oC, w zależności od części ciała i warunków wewnętrznych (wyziębienie, gorączka) i zewnętrznych (warunki atmosferyczne). Grzyby drożdżakowe wzrastać mogą w podobnym zakresie temperatur, jednakże ich optimum wynosi 36^oC – 37^oC (co odpowiada warunkom, jakie panują na przykład w fałdach skórnych). Niektóre gatunki drożdżaków mogą rosnąć nawet w temperaturach wyższych, przykładowo Candida albicans dobrze wzrasta w temperaturze 42^oC oraz 45^oC. Hodowle grzybów pleśniowych mogą wzrastać natomiast w zakresie temperatur 22^oC – 28^oC, przy czym ich optimum wzrostu to temperatura około 25^oC. Wyjątkiem od reguły jest Aspergillus fumigatus, który wykazuje zdolność do wzrostu w temperaturze 70^oC.

Obok temperatury, stężenie jonów wodorowych (pH) należy do najważniejszych czynników fizycznych, wpływających na przemianę materii i wzrost drobnoustrojów. Dermatofity mogą rosnąć w bardzo szerokim przedziale, tzn. 4,0 – 10,0 pH. Ponadto, grzyby te produkują egzoenzymy, takie jak proteazy, które mają zdolność do podnoszenia pH pożywki. Na agarze zawierającym pepton i glukozę, mogą zasadowić środowisko, niezależnie od tego, czy początkowe pH medium jest kwaśne (pH 5,0) czy lekko zasadowe (pH 7,5). Grzyby drożdżakowe oraz pleśniowe również wykazują szeroką tolerancję dla wartości pH pożywki, w przedziale 1,5 – 8,5, przy czym najlepiej rozwijają się w kwaśnym pH pożywki. Należy podkreślić, iż pH podłoża wywiera wyraźny wpływ na szybkość wzrostu oraz na wiele innych procesów życiowych. Pożywka może mieć pH korzystne dla wzrostu, a niekorzystne dla zarodnikowania lub innych procesów komórkowych.

Czas oczekiwania na wzrost dermatofitów jest długi, w zależności od gatunku wynosi on od 3 do 5 tygodni. Hodowle mogą ulec kontaminacji przez bakterie lub wszechobecnie występujące zarodniki szybkorosnących grzybów pleśniowych. Podłoża stosowane w mikologii są, dlatego wzbogacone antybiotykami, które hamują wzrost bakterii oraz niektórych grzybów pleśniowych, a nie wpłyną na wzrost dermatofita.

Zdecydowanie szybciej wzrastają grzyby drożdżakowe – od 2 do 4 dni, w przypadku grzybów pleśniowych, dla niektórych gatunków wzrost grzybni można zauważyć już po 2 dobach, jednakże zazwyczaj hodowle prowadzi się przez 7 dni

Identyfikacja patogenów grzybiczych: Identyfikację gatunkową wyhodowanych organizmów dokonuje się w oparciu o ich cechy makroskopowe oraz mikroskopowe. Cechy makroskopowe hodowli to między innymi zabarwienie, kształt, utkanie kolonii, struktura jej powierzchni, brzegi, konsystencja, zdolność do produkcji barwników, wzniesienie nad powierzchnię podłoża, czy też wydzielany zapach. Cechy mikroskopowe preparatu, barwionego najczęściej błękitem laktofenolowym to ułożenie, kształt rozmiar i rodzaj zarodników (struktury rozmnażania bezpłciowego), występowanie charakterystycznych struktur (na przykład „rogi jelenia”, spiralne strzępki, pseudostrzępki), szerokość oraz sposób rozgałęzienia grzybni, występowanie lub brak przegród, obecność struktur rozmnażania płciowego (np. worki, askospory). W celu uzyskania dobrej jakości preparatów mikroskopowych do oceny morfologii grzybów strzępkowych, można założyć tak zwaną mikrohodowlę szkiełkową. Opiera się ona obserwacji wytwarzania w czasie wzrostu poszczególnych elementów charakterystycznych dla grzybów. Wykonanie mikrohodowli polega na przygotowaniu jałowej, wilgotnej komory (np. szalka Petriego z wodą destylowaną), umieszczeniu w niej szkiełka podstawowego, na które nakłada się bloczek podłoża agarowego (w kształcie prostokątnym bądź kwadratowym, na tyle mały, by zakryło go szkiełko nakrywkowe). Tak przygotowane podłoże zaszczepia się z czterech stron grzybnią i przykrywa się uprzednio wyjałowionym szkiełkiem nakrywkowym. Inkubację prowadzi się w temperaturze 25-27^oC aż do momentu wzrostu i sporulacji grzybów. Następnie można wykonać preparaty z mikrohodowli [18]. W celu wykonania preparatów z mikrohodowli szkiełkowej należy ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe a na powierzchnię, która stykała się z bloczkiem agarowym nanieść kroplę 95% alkoholu (środek zwilżający). Szkiełko nakrywkowe następnie przenosi się na czyste szkiełko podstawowe z kroplą błękitu laktofenolowego. W celu uzyskania drugiego preparatu, należy zdjąć bloczek agarowy ze szkiełka podstawowego użytego do założenia mikrohodowli, a w miejscu, gdzie się on znajdował, nanieść na szkiełko kroplę 95% alkoholu, a następnie kroplę błękitu laktofenolowego. Tak przygotowane szkiełko podstawowe przykrywa się czystym szkiełkiem nakrywkowym. Oba preparaty ocenia się pod mikroskopem w powiększeniach 100x i 400x.

Bardzo często jednak ocena makro- oraz mikroskopowa nie wystarczy, aby dany patogen oznaczyć gatunkowo. Posiew na podłoża różnicujące pozwala na określenie biochemicznych właściwości badanego grzyba. Czasami konieczne jest wykonanie dodatkowych testów identyfikacyjnych, opierających się na właściwościach fizjologicznych oraz asymilacyjnych patogenu.

3. Nowoczesna diagnostyka mykologiczna:

Metody diagnostyki molekularnej opierają się na wykrywaniu materiału genetycznego czynnika etiologicznego w próbkach pobranych od chorego. Dużą zaletą nowoczesnych technik molekularnych jest większa czułość w porównaniu do metod tradycyjnych (w zależności od metody wykrywanie DNA grzyba w ilości zaledwie 50 fg w próbce). Kolejnym pozytywnym aspektem jest znacznie krótszy czas oczekiwania na wynik, który wynosić może nawet kilka godzin, w porównaniu do pięciu tygodniu w klasycznej diagnostyce mikologicznej. Molekularna diagnostyka zakażeń grzybiczych jest na tyle dokładna, iż często pozwala również szybko określić, jaki patogen wywołał zakażenie, a to z kolei daje możliwość dobrania odpowiedniego leczenia. Ponadto, dzięki zastosowaniu metod molekularnych istnieje większe prawdopodobieństwo szybszego wykrycia gatunków rzadko występujących w praktyce laboratoryjnej, co jest bardzo ważnym aspektem, jeśli chodzi o aktualizację danych epidemiologicznych dotyczących zakażeń grzybiczych.

Metody stosowane obecnie w molekularnej diagnostyce zakażeń grzybiczych bazują na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, ang. Polymerase Chain Reaction), która umożliwia amplifikację materiału genetycznego patogenu oraz hybrydyzację ze starterami specyficznymi wobec powielanego DNA bądź sondami znakowanymi izotopowo lub luminescencyjnie. W doborze starterów zapoczątkowujących amplifikację DNA istotne jest to, by powielany fragment występował w genomie w wielu kopiach, gdyż zwiększa to czułość metody. W przypadku grzybów chorobotwórczych do konstrukcji testów diagnostycznych często używa się sekwencji komplementarnych do regionów kodujących rRNA, które zazwyczaj są unikalne dla różnych gatunków drobnoustrojów i występują nawet w dziesiątkach kopii [58, 115]. W skład tych regionów wchodzą wewnętrzne regiony niekodujące (ITS, ang. Internal Transcribed Spacer) charakteryzujące się dużym polimorfizmem wewnętrznym oraz międzygenowy region IGS (Intergenic Spacer Region), który zawiera zewnętrzne fragmenty niekodujące (ETS, ang. External Transcribed Spacer) [25, 38, 145]. Unikalna sekwencja w obrębie regionu ITS pozwala na identyfikację dermatofitów Trichophyton tonsurans (ITS1) oraz Epidermophyton floccosum (ITS2) [21, 53]. Dla niektórych gatunków grzybów homologia w obrębie rDNA jest na tyle wysoka, iż poszukiwane są inne sekwencje kodujące, które pozwolą na ich zróżnicowanie. W tym celu w reakcji PCR amplifikuje się geny enzymów – tubuliny, syntazy chitynowej (w celu wykrycia dermatofitów Trichophyton mentagrophytes i Trichophyton tonsurans, niektórych gatunków z rodzaju Candida,), aktyny (Microsporum canis), topoizomerazy DNA, lanosterol-α-demetylazy bądź też geny mitochondrialnego DNA (mtDNA) – kodujące cytochrom b, dehydrogenazę NADH, podjednostki oksydazy cytochromowej, czy mitochondrialne rybosomy [21, 46, 66, 104, 154]. Dla detekcji Trichophyton rubrum zastosowano również startery zapoczątkowujące amplifikację charakterystycznego dla tego gatunku fragmentu DNA składającego się z mikrosatelitarnych powtórzeń GT [19].

W związku z ciągłym rozwojem diagnostyki molekularnej, powstał szereg modyfikacji klasycznej reakcji PCR. W diagnostyce grzybic znalazły zastosowanie następujące metody:

• AP-PCR (ang. Arbitrarily Primed PCR) – reakcja PCR z użyciem określonej pary starterów.

• Multiplex-PCR (multipleksowy PCR) – reakcja PCR z wykorzystaniem kilku par starterów.

• RT-PCR (ang. Reverse Transcription PCR) – modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Następnie DNA amplifikuje się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA– komplementarny DNA.

• RACE PCR (ang. Rapid Amplification of cDNA Ends PCR, Szybka amplifikacja końców cDNA) – odmiana reakcji PCR, której celem jest poznanie dokładnej sekwencji jednego z końców RNA. W zależności od analizowanego końca stosowana jest metoda 3’RACE lub 5’RACE .

• Real-Time PCR (PCR w czasie rzeczywistym, PCR ilościowy) – metoda ta wykorzystuje pomiar przyrostu produktu PCR w czasie rzeczywistym. Do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.

• PCR-RLFP (ang. Restriction Rragment Length Polymorphism, Polimorfizm długości fragmentów Restrykcyjnych) – polega na trawieniu produktu reakcji PCR enzymami restrykcyjnymi i ocenie długości powstałych fragmentów w porównaniu ze wzorcami charakterystycznymi dla danych gatunków.

• PCR-RLB (ang. Reverse Line Blot) – metoda ta wykorzystuje fakt, iż wewnętrzne regiony niekodujące (ITS1, ITS2) pomiędzy genami rRNA są wystarczająco polimorficzne, by zidentyfikować patogeny na poziomie gatunkowym.

• RAPD-PCR (ang. Rapid Amplification of Polymorphic DNA, Szybka amplifikacja polimorficznego DNA) – metoda polega na użyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Po zakończeniu reakcji i analizie elektroforetycznej otrzymuje się różny układ prążków będący cechą charakterystyczną danego gatunku (fingerprinting). Niestety przez niską temperaturę łączenia starterów (konieczne by uzyskać wystarczającą ilość produktów) metoda ma niską powtarzalność i wynik zależy od wielu trudnych do określenia czynników (np. niewielkie wahania temperatury, użyte odczynniki, czasy nagrzewania/chłodzenia).

• nested-PCR (PCR zagnieżdżony) – wykazuje wyższą czułość detekcji (nawet 50 fg DNA patogenu w materiale klinicznym) w porównaniu do klasycznego PCR, poprzez kombinację dwóch następujących po sobie reakcji PCR z użyciem dwóch par starterów. Wadą metody jest ryzyko kontaminacji próbek.

• PCR-EIA – połączenie metody PCR oraz immunoenzymatycznej, w metodzie tej stosuje się startery uniwersalne a oprócz tego sondy (specyficzne dla rodzaju lub gatunku), znakowane biotyną lub dioksygeniną.

Oprócz wymienionych metod do identyfikacji rzadkich gatunków grzybów wykorzystuje się analizę sekwencji genów. Technika ta polega na zastosowaniu starterów uniwersalnych, które zapoczątkowują amplifikację konserwatywnych regionów genomu drobnoustrojów a następnie analizuje się sekwencję uzyskanego amplikonu. Identyfikacja gatunkowa jest przeprowadzona przez porównanie otrzymanej sekwencji z sekwencjami umieszczonymi w bazach danych takich jak GenBank. W przypadku, gdy patogen nie posiada odpowiednika w bazie danych, metoda ta pozwala na umieszczenie go między gatunkami najbliżej spokrewnionymi filogenetycznie.

Do molekularnych metod diagnostycznych rozwijanych w ostatnim czasie, które znajdują zastosowanie do identyfikacji grzybów patogennych należy zaliczyć techniki chipowe wykorzystujące mikromacierze DNA (microarray). W tej metodzie specyficzne sondy molekularne (np. gatunkowo-specyficzne dobrane na podstawie informacji z baz danych) umieszczane są na płytkach szklanych bądź nylonowych. Następnie obserwuje się hybrydyzację produktu amplifikacji PCR w analizowanych próbkach z sondami molekularnymi. Do opracowania sond molekularnych najczęściej służą regiony ITS1 lub ITS2. W procesie PCR używa się znakowanych nukleotydów i dzięki temu wynik odczytuje się na podstawie sygnału fluorescencji. Metoda ta znalazła szerokie zastosowanie również w innych działach diagnostyki medycznej i służy do analizy ekspresji genów odpowiedzialnych za wirulencję i odpowiedź immunologiczną.

Diagnostyka mikologiczna z zastosowaniem metod molekularnych wymaga dokładnego i uważnego opracowywania materiału badanego. Prawidłowe pobranie próbki od pacjenta może decydować o uzyskania materiału genetycznego patogenu w ilości odpowiedniej do przeprowadzenia reakcji PCR i o wyniku testu. Przed izolacją DNA należy przeprowadzić wstępną obróbkę materiału badanego, jaką jest homogenizacja (zwłaszcza w przypadku tkanek) oraz liza.

Kluczowymi etapami przy standaryzacji reakcji łańcuchowej polimerazy jest dobranie składu mieszaniny reakcyjnej w odpowiednich proporcjach, które zapewniają otrzymanie określonego produktu. Dużą rolę odgrywa także dobranie profilu temperaturowego i ilości cykli amplifikacji w celu maksymalizacji procesu. Szczególnie ważne jest unikanie zanieczyszczeń chemicznych analizowanych próbek, ponieważ niektóre odczynniki mogą wpływać na wydajność reakcji PCR. Do inhibitorów procesu zalicza się między innymi kwas wersenowy (EDTA), który chelatuje jony magnezu będące kofaktorem dla termostabilnej polimerazy DNA. Innymi inhibitorami reakcji są: agaroza, etanol, izopropanol, chlorki sodu i potasu, czy też detergenty. Stężenie matrycowego DNA również wywiera wpływ na reakcję PCR. Zbyt mała jego ilość w mieszaninie reakcyjnej powoduje, iż można nie uzyskać pożądanego produktu, natomiast jego zbyt duże stężenie hamuje proces.

Zastosowanie metod molekularnych w diagnostyce mikologicznej umożliwia wykrycie obecności patogenu nawet w sytuacji, gdy pacjent przyjmuje leczenie a obecność antymikotyków hamuje wzrost grzybów na pożywkach.