Z tego, co udaje nam się obserwować w naszej pracy, Pacjenci (ale czasami też lekarze) często powielają mity dotyczące grzybicy.

Poniżej przedstawimy Państwu najczęściej poruszane zagadnienia z odpowiedziami.

„To na pewno grzybica paznokci! Bo co innego?” Odpowiedzi na to pytanie jest kilka i trzeba na początku zastanowić się, w jakich okolicznościach pojawiły się zmiany na paznokciu/bądź paznokciach. Jeśli paznokieć był uszkodzony mechanicznie, mogło dojść do trwałych zmian w jego macierzy. Ten paznokieć może już nigdy nie wrócić do swojego pierwotnego wyglądu. Dobrze jest faktycznie sprawdzić, czy przy okazji nie doszło do nadkażenia grzybami patogennymi, zwłaszcza, jeśli stan paznokcia zaczyna się pogarszać i towarzyszy temu niemiły zapach. Niemniej jednak – jeżeli najpierw był uraz mechaniczny paznokcia, a potem wdało się zakażenie grzybicze, proszę pamiętać, że w tej sytuacji leczymy grzybicę, co poprawi nieco stan paznokcia ale nie naprawi uszkodzeń mechanicznych macierzy. Należy wtedy udać się do podologa, który opracuje paznokieć w odpowiedni sposób. Uszkodzenia mechaniczne kilku paznokci na przykład spowodowane wadami stopy – haluksami, czy też ciasnymi butami są zazwyczaj SYMETRYCZNE i dotyczą np tylko paznokci paluchów stóp. Grzybica bardzo rzadko bywa symetryczna.
Drugą sprawą są choroby, które mogą przypominać grzybicę paznokci – na przykład łuszczyca bądź liszaj płaski. Badanie mykologiczne pomaga nam rozpoznać, czy możemy grzybicę potwierdzić, czy wykluczyć. Jeżeli w rodzinie występują zmiany skórne o nieznanej etiologii, a u Państwa pojawiły się zmiany w obrębie paznokci rąk czy stóp (zazwyczaj paluchy stóp), można zrobić badanie mykologiczne oraz badanie na obecność genu łuszczycowego HLA-cw6. Proszę również pamiętać o tym, że takie paznokcie jak magnes przyciągają grzyby patogenne i bardzo często obserwujemy współistnienie grzybicy i łuszczycy paznokci u pacjentów.
„Ale grzybica powinna się przenosić na inne paznokcie!” Nie. Wcale nie musi, zależy to od wielu czynników, na przykład od naszej odporności a także od gatunku grzyba, który wywołuje zakażenie. Niektóre gatunki są po prostu bardziej wirulentne od innych, stąd też łatwiej kolonizują nowe obszary ciała. Inne gatunki z kolei mogą latami bytować na jednym paznokciu i nie zakażać innych.
„Chcę powtórzyć badanie, w badaniu mikroskopowym wyszło, że jest grzybica, w hodowli nic nie wyszło – nie wiem czy mam grzybicę?” Tak, jeśli preparat został oceniony prawidłowo przez osobę wykwalifikowaną to jak najbardziej obecność struktur grzybni pod mikroskopem świadczy o tym, że jest to zakażenie grzybicze. Niestety, hodowla nie powinna być już w tej chwili kryterium diagnostycznym a jedynie badaniem dodatkowym. Na hodowli często NIE ROSNĄ grzyby – wynika to z ich zdolności reprodukcyjnej w środowisku sztucznym oraz faktu, że do podłoży dodawane są antybiotyki ograniczające wzrost bakterii ale również, paradoksalnie, grzybów, które często są typowym zanieczyszczeniem próbki, ale właśnie te antybiotyki mają fatalny wpływ na to, że grzyb, który mamy na skórze czy na paznokciach, nie urośnie na podłożu. W przypadku badań PCR nie ma takiej obawy – polegają one na wykrywaniu DNA, więc nic nie hodujemy, metoda jest czulsza i pozwala na wykrycie niemal wszystkich patogenów grzybiczych, które odpowiadają za zakażenie grzybicze.

Na razie to tyle, cdn 🙂

Zapraszamy śmiało do pozostawienia komentarza, jeśli przychodzą Państwu jakieś pytania do głowy – odpowiemy na nie z miłą chęcią 🙂

Derma-Lab

CZYTAJ DALEJ

Epidemiologia grzybic – zestawienie aktualnej wiedzy.

Zakażenia grzybicze należą do jednych z najczęstszych chorób infekcyjnych w dermatologii. Grzybice powierzchowne wywołują dermatofity, drożdżaki oraz bardzo rzadko grzyby pleśniowe .

Dermatofity są drobnoustrojami przystosowanymi do zakażania skóry i przydatków skórnych dzięki zdolności rozkładania keratyny. Powodują grzybice skóry gładkiej, stóp, rąk, włosów i paznokci. Zakażenie dermatofitami następuje w sposób bezpośredni od chorych ludzi (np. grzybica skóry owłosionej u dzieci), od zwierząt (zakażenia grzybami zoofilnymi) i na drodze pośredniej na basenach i w łaźniach, z których korzysta wiele osób (grzybica stóp).

Obecnie obserwuje się wzrastającą liczbę powierzchownych grzybic skóry i jej przydatków. Grzybica stóp i paznokci stóp określana jest mianem infekcji cywilizacyjnej ze względu na dużą częstość występowania. Około 22% populacji w krajach rozwiniętych cierpi na grzybicę stóp. Istnieją pewne czynniki, które sprzyjają rozprzestrzenianiu się zakażeń dermatofitowych. Rozwojowi grzybów sprzyja środowisko wilgotne i ciepłe. Używanie obuwia nieprzewiewnego, szczególnie związane z wymogami w pewnych zawodach (górnicy, żołnierze) oraz uprawieniem sportu (biegacze) predysponuje do grzybicy stóp. Zwiększa się również możliwość zakażenia poprzez kontakt z zarodnikami grzybów dermatofitowych na basenach i we wspólnych łaźniach. W ostatnim czasie ukształtowały się nowe trendy w sposobie spędzania wolnego czasu. Mieszkańcy dużych miast coraz częściej uprawiają sport, uczęszczają na siłownię czy basen, korzystają ze wspólnych pryszniców, saun oraz łaźni. Do rozprzestrzeniania się różnych gatunków dermatofitów przyczynia się także większa możliwość podróżowania.

Grzybice dermatofitowe wywołane przez grzyby antropofilne, a szczególnie grzybica stóp i paznokci stóp jest obserwowana częściej u osób starszych. Wraz z wiekiem zdecydowanie rośnie odsetek tych zakażeń. Jest to prawdopodobnie związane z większą podatnością na patogeny grzybicze, spadkiem odporności, korzystaniem z basenów rekreacyjnych, saun oraz łaźni a także z faktem, iż w miarę starzenia się wzrost płytek paznokci stóp jest wolniejszy. Zwiększająca się liczba osób w podeszłym wieku w społeczeństwie wpływa, zatem na zwiększenie się ilości zakażeń grzybami dermatofitowymi [24]. Wśród dzieci i młodzieży natomiast najczęstsze są infekcje owłosionej skóry głowy oraz skóry gładkiej, będące wynikiem zakażeń bezpośrednich od innych chorych dzieci lub zwierząt domowych. U dzieci rzadko obserwuje się zakażeń paznokci rąk, paznokci stóp czy samych stóp. Szybki wzrost płytek paznokciowych w tej grupie wiekowej ułatwia eliminowanie patogenu i przeciwdziała rozwojowi zakażenia.

Czynnikami ułatwiającymi zakażenie dermatofitowe są także urazy paznokci, nadmierna potliwość stóp oraz długa kuracja preparatami kortykosteroidowymi.

Schorzenia wywołane przez grzyby drożdżakowe są najczęściej spowodowane nadmiernym namnażaniem się i rozprzestrzenianiem saprofitujących u pacjenta grzybów. Drożdżaki są częstymi komensalami człowieka. C. albicans jest saprofitem u zdrowych osób w jamie ustnej, w przewodzie pokarmowym i w pochwie u zdrowych kobiet. Zakażenie drożdżakowe może być też przekazane bezpośrednio lub pośrednio od chorego. Ma to miejsce w przypadku zakażenia noworodka od matki chorej na drożdżycę pochwy oraz zakażenia przez kontakt seksualny. Czynniki predysponujące do wystąpienia powierzchownych zakażeń drożdżakowych można podzielić na ogólnoustrojowe i lokalne. Do ogólnoustrojowych zaliczamy: tło jatrogenne, czyli stosowanie antybiotykoterapii i leków immunosupresyjnych u osób po przeszczepach narządów, obniżenie odporności spowodowane schorzeniami takimi jak AIDS, cukrzyca, choroby nowotworowe krwi a także stany fizjologiczne jak ciąża i okres noworodkowy. Czynnikami lokalnymi są: ciepło, brak dostępu powietrza, wilgotność związane z używaniem nieprzewiewnej odzieży; uszkodzenie bariery nabłonkowej spowodowane np. używaniem źle dopasowanych protez zębowych; lokalne stosowanie wziewnych preparatów kortykosteroidowych w postaci aerosoli w leczeniu astmy oskrzelowej. Rozwój medycyny przyczynił się, do zwiększenia się ilość pacjentów przewlekle chorych z zaburzoną odpornością, po przeszczepach narządów i szpiku, cierpiących na choroby nowotworowe krwi, u których istnieje większe narażenie na rozwój objawowych zakażeń drożdżakowych.

Grzyby pleśniowe zdecydowanie najrzadziej wywołują zakażenia powierzchowne, mimo, iż występują powszechnie w środowisku otaczającym człowieka. Szczególnie predysponowaną grupą do wystąpienia infekcji grzybiczej spowodowanej przez pewne gatunki pleśni są osoby starsze, u których kumulują się czynniki ryzyka a także pacjenci chorzy na nowotwory krwi.

Spektrum występowania różnych gatunków grzybów chorobotwórczych w danym rejonie geograficznym nie jest stałe. Zmienność częstości występowania poszczególnych gatunków w danym rejonie jest skutkiem migracji ludności, zmieniającej się sytuacji społeczno – ekonomicznej, stosowanymi metodami terapeutycznymi, czy też zmianami klimatycznymi. Z tego względu, jedne gatunki grzybów wypierane są przez inne, rozprzestrzeniające się w danym rejonie geograficznym. Patogeny, które zajmują miejsce swoich poprzedników są zazwyczaj lepiej przystosowane do nowych wymagań środowiskowych.

Z prac opublikowanych na ten temat wynika, iż w Polsce dermatofity są najbardziej powszechnymi czynnikami etiologicznymi powierzchownych zakażeń grzybiczych skóry i jej przydatków. Odsetek grzybów dermatofitowych izolowanych ze zmian chorobowych w różnych okresach i rejonach geograficznych kraju wynosi pomiędzy 50% a 60%.

Kolejną dużą grupą będącą przyczyną infekcji grzybiczych u ludzi są grzyby drożdżakowe, a w szczególności gatunki z rodzaju Candida. W przypadku zakażeń tymi patogenami, częstość izolacji wynosi pomiędzy 30% a 40%.

Grzyby pleśniowe z kolei najrzadziej bywają czynnikami etiologicznymi powierzchownych infekcji grzybiczych. Zakażenia wywołane przez te patogeny dotyczą zazwyczaj mniej niż 10% wszystkich diagnozowanych infekcji grzybiczych.

W latach 50. i 60. XX wieku w Polsce dominowały dermatofity zoofilne wśród czynników wywołujących dermatomikozy i stanowiły 69% wszystkich identyfikowanych patogenów grzybiczych. Dermatofity antropofilne w tamtym okresie izolowano w 30% przypadków, natomiast dermatofity geofilne jedynie w 1% przypadków. Sytuacja ta zmieniła się w latach 80. i 90. XX wieku. Na pierwsze miejsce wysunęły się antropofilne gatunki dermatofiów (60%), z kolei gatunki zoofilne izolowano o wiele rzadziej, bo w 39% przypadków. Nie zmieniła się natomiast częstość izolacji geofilnych gatunków tych grzybów i w dalszym ciągu wynosiła ona 1%.

Obecnie gatunkiem izolowanym w Polsce najczęściej wśród dermatofitow jest Trichophyton rubrum. Częstość zakażenia tym grzybem wzrasta od drugiej połowy XX wieku. Co ciekawe, w pierwszej połowie XX wieku gatunkiem izolowanym najczęściej był inny antropofilny dermatofit – Trichophyton schoenleinii, jednakże sytuacja zmieniła się wraz z postępującą poprawą warunków sanitarnych. Z doniesień epidemiologicznych wynika, iż obecnie drugim, co do częstości izolacji grzybem dermatofitowym jest zoofilny gatunek – Trcihophyton mentagrophytes. Jest to patogen małych zwierząt takich, jak gryzonie – myszy, świnki morskie, króliki, zwierząt domowych – kotów i psów oraz zwierząt hodowlanych – owiec, świń, koni, czy też zwierząt dzikich – takich jak małpy, lisy, kangury [10, 69]. Kolejnymi ważnymi patogenami, wśród grupy grzybów dermatofitowych są antropofilne – Trichophyton interdigitale oraz Trichophyton tonsurans a także zoofilny Microsporum canis. Częstość ich występowania zależy od regionu geograficznego oraz od grupy wiekowej – zwłaszcza Microsporum canis jest częstym patogenem dzieci w wieku przedszkolnym i szkolnym.

Wśród grzybów drożdżakowych najczęściej za zakażenia błon śluzowych, skóry i jej przydatków są odpowiedzialne gatunki przynależące do rodzaju Candida. Najważniejszym patogenem w obrębie tej grupy jest Candida albicans. Gatunek ten wywołuje zakażenia paznokci rąk, jamy ustnej oraz pochwy, a także fałdów skórnych. Pozostałe gatunki izolowane ze zmian chorobowych to głównie Candida glabrata, Candida parapsilosis czy Candida tropicalis.

Najczęściej izolowanym patogenem wśród grzybów pleśniowych, jest Scopulariopsis brevicaulis, wywołujący akauliozę paznokci stóp. W większości przypadków zakażenie poprzedza uszkodzenie płytek paznokciowych. Z danych literaturowych wynika również, iż ostatnimi czasy wzrasta częstość infekcji skórnych powodowanych przez grzyby z rodzaju Acremonium czy też Aspergillus.

Dane epidemiologiczne wskazują, jak bardzo na przestrzeni dziesięcioleci zmienia się spektrum czynników etiologicznych powierzchownych grzybic skóry i jej przydatków, co jest wypadkową wielu zmiennych.

CZYTAJ DALEJ

Diagnostyka mykologiczna

Na czym polega diagnostyka mykologiczna, jakie metody wykorzystuje się wykonując badanie mykologiczne? Dokładny opis stosowanych technik znajdziecie Państwo poniżej:

1.Wstępna ocena ogniska chorobowego:

Przed pobraniem materiału do badania mykologicznego pomocna jest ocena ognisk chorobowych w świetle lampy Wooda. Jest to przenośna lampa kwarcowa, w której dzięki zastosowaniu specjalnego czarnego filtra, (filtr Wooda zbudowany z krzemianu baru z dodatkiem 9% tlenku niklu, którego pasmo przepustowości wynosi od 320 do 400 nm z maksimum w 365 nm), emitowane jest długofalowe promieniowanie nadfioletowe. Promieniowanie to 'bombarduje’ komórki grzyba i w efekcie zaczynają one silnie fluoryzować w świetle lampy. Pozwala to na wstępne rozpoznanie pewnych typów zakażenia grzybiczego. Grzybica drobnozarodnikowa wywołana przez Microsporum canis daje w świetle lampy Wooda charakterystyczną, zielonkawą fluorescencję, natomiast łupież pstry wywołany przez Malassezia furfur charakteryzuje się żółto-białą fluorescencją.

2.Konwencjonalna diagnostyka zakażeń grzybiczych:

Na tradycyjne badanie mykologiczne składa się badanie bezpośrednie, badanie hodowlane oraz dodatkowe testy fizjologiczne i biochemiczne.

Badanie bezpośrednie: Polega na wykrywaniu elementów struktury grzyba (nici, zarodniki) w materiale pobranym od pacjenta (łuski skórne, włosy, paznokcie). Materiał ten poddaje się działaniu roztworu rozjaśniającego: 10-20% wodorotlenku potasu (KOH) z dodatkiem 40% dimetylosulfotlenku (DMSO) i ogląda się w mikroskopie, w powiększeniu 400x. Preparaty do badań bezpośrednich można wybarwiać także atramentem Parkera, oranżem akrydyny, czy fluorochromami. Ważne jest to, iż badaniem tym nie można wykluczyć grzybicy, można ją jedynie potwierdzić. Badanie bezpośrednie może być fałszywie ujemne, zwłaszcza, jeżeli preparat jest zbyt gruby, nie został poddany wystarczająco długo działaniu roztworu rozjaśniającego, czy też nie został obejrzany przez osobę wyspecjalizowaną w tej dziedzinie.

Badanie hodowlane: Z pozostałej części materiału pobranego do badania zakładana jest hodowla, najczęściej na podłożu Sabourauda. Grzyby patogenne są anaerobami, z tego względu też ich hodowlę należy prowadzić w probówkach z korkami ligninowymi, bądź metalowymi zakrętkami, przy uprzednim upewnieniu się, iż nie są one szczelnie zakręcone. Niektóre gatunki grzybów są bardzo wrażliwe na brak tlenu – w warunkach beztlenowych hodowla szybko ginie. Ważne są również warunki prowadzenia hodowli, takie jak temperatura. Przykładowo, dla dermatofitów optimum temperatury waha się w granicach 25^oC – 37^oC (obecnie przyjmuje się, iż najlepsza temperatura dla ich wzrostu i rozwoju to 26^oC), co odpowiada temperaturze powierzchni skóry, która, jak wiadomo, utrzymuje się w granicach 30^oC – 34^oC, w zależności od części ciała i warunków wewnętrznych (wyziębienie, gorączka) i zewnętrznych (warunki atmosferyczne). Grzyby drożdżakowe wzrastać mogą w podobnym zakresie temperatur, jednakże ich optimum wynosi 36^oC – 37^oC (co odpowiada warunkom, jakie panują na przykład w fałdach skórnych). Niektóre gatunki drożdżaków mogą rosnąć nawet w temperaturach wyższych, przykładowo Candida albicans dobrze wzrasta w temperaturze 42^oC oraz 45^oC. Hodowle grzybów pleśniowych mogą wzrastać natomiast w zakresie temperatur 22^oC – 28^oC, przy czym ich optimum wzrostu to temperatura około 25^oC. Wyjątkiem od reguły jest Aspergillus fumigatus, który wykazuje zdolność do wzrostu w temperaturze 70^oC.

Obok temperatury, stężenie jonów wodorowych (pH) należy do najważniejszych czynników fizycznych, wpływających na przemianę materii i wzrost drobnoustrojów. Dermatofity mogą rosnąć w bardzo szerokim przedziale, tzn. 4,0 – 10,0 pH. Ponadto, grzyby te produkują egzoenzymy, takie jak proteazy, które mają zdolność do podnoszenia pH pożywki. Na agarze zawierającym pepton i glukozę, mogą zasadowić środowisko, niezależnie od tego, czy początkowe pH medium jest kwaśne (pH 5,0) czy lekko zasadowe (pH 7,5). Grzyby drożdżakowe oraz pleśniowe również wykazują szeroką tolerancję dla wartości pH pożywki, w przedziale 1,5 – 8,5, przy czym najlepiej rozwijają się w kwaśnym pH pożywki. Należy podkreślić, iż pH podłoża wywiera wyraźny wpływ na szybkość wzrostu oraz na wiele innych procesów życiowych. Pożywka może mieć pH korzystne dla wzrostu, a niekorzystne dla zarodnikowania lub innych procesów komórkowych.

Czas oczekiwania na wzrost dermatofitów jest długi, w zależności od gatunku wynosi on od 3 do 5 tygodni. Hodowle mogą ulec kontaminacji przez bakterie lub wszechobecnie występujące zarodniki szybkorosnących grzybów pleśniowych. Podłoża stosowane w mikologii są, dlatego wzbogacone antybiotykami, które hamują wzrost bakterii oraz niektórych grzybów pleśniowych, a nie wpłyną na wzrost dermatofita.

Zdecydowanie szybciej wzrastają grzyby drożdżakowe – od 2 do 4 dni, w przypadku grzybów pleśniowych, dla niektórych gatunków wzrost grzybni można zauważyć już po 2 dobach, jednakże zazwyczaj hodowle prowadzi się przez 7 dni

Identyfikacja patogenów grzybiczych: Identyfikację gatunkową wyhodowanych organizmów dokonuje się w oparciu o ich cechy makroskopowe oraz mikroskopowe. Cechy makroskopowe hodowli to między innymi zabarwienie, kształt, utkanie kolonii, struktura jej powierzchni, brzegi, konsystencja, zdolność do produkcji barwników, wzniesienie nad powierzchnię podłoża, czy też wydzielany zapach. Cechy mikroskopowe preparatu, barwionego najczęściej błękitem laktofenolowym to ułożenie, kształt rozmiar i rodzaj zarodników (struktury rozmnażania bezpłciowego), występowanie charakterystycznych struktur (na przykład „rogi jelenia”, spiralne strzępki, pseudostrzępki), szerokość oraz sposób rozgałęzienia grzybni, występowanie lub brak przegród, obecność struktur rozmnażania płciowego (np. worki, askospory). W celu uzyskania dobrej jakości preparatów mikroskopowych do oceny morfologii grzybów strzępkowych, można założyć tak zwaną mikrohodowlę szkiełkową. Opiera się ona obserwacji wytwarzania w czasie wzrostu poszczególnych elementów charakterystycznych dla grzybów. Wykonanie mikrohodowli polega na przygotowaniu jałowej, wilgotnej komory (np. szalka Petriego z wodą destylowaną), umieszczeniu w niej szkiełka podstawowego, na które nakłada się bloczek podłoża agarowego (w kształcie prostokątnym bądź kwadratowym, na tyle mały, by zakryło go szkiełko nakrywkowe). Tak przygotowane podłoże zaszczepia się z czterech stron grzybnią i przykrywa się uprzednio wyjałowionym szkiełkiem nakrywkowym. Inkubację prowadzi się w temperaturze 25-27^oC aż do momentu wzrostu i sporulacji grzybów. Następnie można wykonać preparaty z mikrohodowli [18]. W celu wykonania preparatów z mikrohodowli szkiełkowej należy ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe a na powierzchnię, która stykała się z bloczkiem agarowym nanieść kroplę 95% alkoholu (środek zwilżający). Szkiełko nakrywkowe następnie przenosi się na czyste szkiełko podstawowe z kroplą błękitu laktofenolowego. W celu uzyskania drugiego preparatu, należy zdjąć bloczek agarowy ze szkiełka podstawowego użytego do założenia mikrohodowli, a w miejscu, gdzie się on znajdował, nanieść na szkiełko kroplę 95% alkoholu, a następnie kroplę błękitu laktofenolowego. Tak przygotowane szkiełko podstawowe przykrywa się czystym szkiełkiem nakrywkowym. Oba preparaty ocenia się pod mikroskopem w powiększeniach 100x i 400x.

Bardzo często jednak ocena makro- oraz mikroskopowa nie wystarczy, aby dany patogen oznaczyć gatunkowo. Posiew na podłoża różnicujące pozwala na określenie biochemicznych właściwości badanego grzyba. Czasami konieczne jest wykonanie dodatkowych testów identyfikacyjnych, opierających się na właściwościach fizjologicznych oraz asymilacyjnych patogenu.

3. Nowoczesna diagnostyka mykologiczna:

Metody diagnostyki molekularnej opierają się na wykrywaniu materiału genetycznego czynnika etiologicznego w próbkach pobranych od chorego. Dużą zaletą nowoczesnych technik molekularnych jest większa czułość w porównaniu do metod tradycyjnych (w zależności od metody wykrywanie DNA grzyba w ilości zaledwie 50 fg w próbce). Kolejnym pozytywnym aspektem jest znacznie krótszy czas oczekiwania na wynik, który wynosić może nawet kilka godzin, w porównaniu do pięciu tygodniu w klasycznej diagnostyce mikologicznej. Molekularna diagnostyka zakażeń grzybiczych jest na tyle dokładna, iż często pozwala również szybko określić, jaki patogen wywołał zakażenie, a to z kolei daje możliwość dobrania odpowiedniego leczenia. Ponadto, dzięki zastosowaniu metod molekularnych istnieje większe prawdopodobieństwo szybszego wykrycia gatunków rzadko występujących w praktyce laboratoryjnej, co jest bardzo ważnym aspektem, jeśli chodzi o aktualizację danych epidemiologicznych dotyczących zakażeń grzybiczych.

Metody stosowane obecnie w molekularnej diagnostyce zakażeń grzybiczych bazują na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, ang. Polymerase Chain Reaction), która umożliwia amplifikację materiału genetycznego patogenu oraz hybrydyzację ze starterami specyficznymi wobec powielanego DNA bądź sondami znakowanymi izotopowo lub luminescencyjnie. W doborze starterów zapoczątkowujących amplifikację DNA istotne jest to, by powielany fragment występował w genomie w wielu kopiach, gdyż zwiększa to czułość metody. W przypadku grzybów chorobotwórczych do konstrukcji testów diagnostycznych często używa się sekwencji komplementarnych do regionów kodujących rRNA, które zazwyczaj są unikalne dla różnych gatunków drobnoustrojów i występują nawet w dziesiątkach kopii [58, 115]. W skład tych regionów wchodzą wewnętrzne regiony niekodujące (ITS, ang. Internal Transcribed Spacer) charakteryzujące się dużym polimorfizmem wewnętrznym oraz międzygenowy region IGS (Intergenic Spacer Region), który zawiera zewnętrzne fragmenty niekodujące (ETS, ang. External Transcribed Spacer) [25, 38, 145]. Unikalna sekwencja w obrębie regionu ITS pozwala na identyfikację dermatofitów Trichophyton tonsurans (ITS1) oraz Epidermophyton floccosum (ITS2) [21, 53]. Dla niektórych gatunków grzybów homologia w obrębie rDNA jest na tyle wysoka, iż poszukiwane są inne sekwencje kodujące, które pozwolą na ich zróżnicowanie. W tym celu w reakcji PCR amplifikuje się geny enzymów – tubuliny, syntazy chitynowej (w celu wykrycia dermatofitów Trichophyton mentagrophytes i Trichophyton tonsurans, niektórych gatunków z rodzaju Candida,), aktyny (Microsporum canis), topoizomerazy DNA, lanosterol-α-demetylazy bądź też geny mitochondrialnego DNA (mtDNA) – kodujące cytochrom b, dehydrogenazę NADH, podjednostki oksydazy cytochromowej, czy mitochondrialne rybosomy [21, 46, 66, 104, 154]. Dla detekcji Trichophyton rubrum zastosowano również startery zapoczątkowujące amplifikację charakterystycznego dla tego gatunku fragmentu DNA składającego się z mikrosatelitarnych powtórzeń GT [19].

W związku z ciągłym rozwojem diagnostyki molekularnej, powstał szereg modyfikacji klasycznej reakcji PCR. W diagnostyce grzybic znalazły zastosowanie następujące metody:

AP-PCR (ang. Arbitrarily Primed PCR) – reakcja PCR z użyciem określonej pary starterów.

Multiplex-PCR (multipleksowy PCR) – reakcja PCR z wykorzystaniem kilku par starterów.

RT-PCR (ang. Reverse Transcription PCR) – modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Następnie DNA amplifikuje się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA– komplementarny DNA.

RACE PCR (ang. Rapid Amplification of cDNA Ends PCR, Szybka amplifikacja końców cDNA) – odmiana reakcji PCR, której celem jest poznanie dokładnej sekwencji jednego z końców RNA. W zależności od analizowanego końca stosowana jest metoda 3’RACE lub 5’RACE .

Real-Time PCR (PCR w czasie rzeczywistym, PCR ilościowy) – metoda ta wykorzystuje pomiar przyrostu produktu PCR w czasie rzeczywistym. Do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.

PCR-RLFP (ang. Restriction Rragment Length Polymorphism, Polimorfizm długości fragmentów Restrykcyjnych) – polega na trawieniu produktu reakcji PCR enzymami restrykcyjnymi i ocenie długości powstałych fragmentów w porównaniu ze wzorcami charakterystycznymi dla danych gatunków.
PCR-RLB (ang. Reverse Line Blot) – metoda ta wykorzystuje fakt, iż wewnętrzne regiony niekodujące (ITS1, ITS2) pomiędzy genami rRNA są wystarczająco polimorficzne, by zidentyfikować patogeny na poziomie gatunkowym.

RAPD-PCR (ang. Rapid Amplification of Polymorphic DNA, Szybka amplifikacja polimorficznego DNA) – metoda polega na użyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Po zakończeniu reakcji i analizie elektroforetycznej otrzymuje się różny układ prążków będący cechą charakterystyczną danego gatunku (fingerprinting). Niestety przez niską temperaturę łączenia starterów (konieczne by uzyskać wystarczającą ilość produktów) metoda ma niską powtarzalność i wynik zależy od wielu trudnych do określenia czynników (np. niewielkie wahania temperatury, użyte odczynniki, czasy nagrzewania/chłodzenia).

nested-PCR (PCR zagnieżdżony) – wykazuje wyższą czułość detekcji (nawet 50 fg DNA patogenu w materiale klinicznym) w porównaniu do klasycznego PCR, poprzez kombinację dwóch następujących po sobie reakcji PCR z użyciem dwóch par starterów. Wadą metody jest ryzyko kontaminacji próbek.

PCR-EIA – połączenie metody PCR oraz immunoenzymatycznej, w metodzie tej stosuje się startery uniwersalne a oprócz tego sondy (specyficzne dla rodzaju lub gatunku), znakowane biotyną lub dioksygeniną.

Oprócz wymienionych metod do identyfikacji rzadkich gatunków grzybów wykorzystuje się analizę sekwencji genów. Technika ta polega na zastosowaniu starterów uniwersalnych, które zapoczątkowują amplifikację konserwatywnych regionów genomu drobnoustrojów a następnie analizuje się sekwencję uzyskanego amplikonu. Identyfikacja gatunkowa jest przeprowadzona przez porównanie otrzymanej sekwencji z sekwencjami umieszczonymi w bazach danych takich jak GenBank. W przypadku, gdy patogen nie posiada odpowiednika w bazie danych, metoda ta pozwala na umieszczenie go między gatunkami najbliżej spokrewnionymi filogenetycznie.

Do molekularnych metod diagnostycznych rozwijanych w ostatnim czasie, które znajdują zastosowanie do identyfikacji grzybów patogennych należy zaliczyć techniki chipowe wykorzystujące mikromacierze DNA (microarray). W tej metodzie specyficzne sondy molekularne (np. gatunkowo-specyficzne dobrane na podstawie informacji z baz danych) umieszczane są na płytkach szklanych bądź nylonowych. Następnie obserwuje się hybrydyzację produktu amplifikacji PCR w analizowanych próbkach z sondami molekularnymi. Do opracowania sond molekularnych najczęściej służą regiony ITS1 lub ITS2. W procesie PCR używa się znakowanych nukleotydów i dzięki temu wynik odczytuje się na podstawie sygnału fluorescencji. Metoda ta znalazła szerokie zastosowanie również w innych działach diagnostyki medycznej i służy do analizy ekspresji genów odpowiedzialnych za wirulencję i odpowiedź immunologiczną.

Diagnostyka mikologiczna z zastosowaniem metod molekularnych wymaga dokładnego i uważnego opracowywania materiału badanego. Prawidłowe pobranie próbki od pacjenta może decydować o uzyskania materiału genetycznego patogenu w ilości odpowiedniej do przeprowadzenia reakcji PCR i o wyniku testu. Przed izolacją DNA należy przeprowadzić wstępną obróbkę materiału badanego, jaką jest homogenizacja (zwłaszcza w przypadku tkanek) oraz liza.

Kluczowymi etapami przy standaryzacji reakcji łańcuchowej polimerazy jest dobranie składu mieszaniny reakcyjnej w odpowiednich proporcjach, które zapewniają otrzymanie określonego produktu. Dużą rolę odgrywa także dobranie profilu temperaturowego i ilości cykli amplifikacji w celu maksymalizacji procesu. Szczególnie ważne jest unikanie zanieczyszczeń chemicznych analizowanych próbek, ponieważ niektóre odczynniki mogą wpływać na wydajność reakcji PCR. Do inhibitorów procesu zalicza się między innymi kwas wersenowy (EDTA), który chelatuje jony magnezu będące kofaktorem dla termostabilnej polimerazy DNA. Innymi inhibitorami reakcji są: agaroza, etanol, izopropanol, chlorki sodu i potasu, czy też detergenty. Stężenie matrycowego DNA również wywiera wpływ na reakcję PCR. Zbyt mała jego ilość w mieszaninie reakcyjnej powoduje, iż można nie uzyskać pożądanego produktu, natomiast jego zbyt duże stężenie hamuje proces.

Zastosowanie metod molekularnych w diagnostyce mikologicznej umożliwia wykrycie obecności patogenu nawet w sytuacji, gdy pacjent przyjmuje leczenie a obecność antymikotyków hamuje wzrost grzybów na pożywkach.

CZYTAJ DALEJ

Grzybice powierzchowne skóry, włosów i paznokci

Grzyby wywołujące grzybice powierzchowne skóry, włosów czy też paznokci, należą do 3 typów. Poniżej podana została charakterystyka każdego z nich, począwszy od najczęściej izolowanych patogenów:

1.Dermatofity

Pojęcie „dermatofity” wywodzi się z języka greckiego i oznacza „rośliny skóry”. Nazewnictwo to jest nieprzypadkowe, ponieważ te wysoce wyspecjalizowane mikroorganizmy stanowią grupę blisko spokrewnionych grzybów, które posiadają rzadką zdolność do rozkładania keratyny zawartej w glebie. Jednakże, w toku ewolucji patogeny te przystosowały się do metabolizowania tego związku występującego w skórze i jej przydatkach zarówno u ludzi, jak i u zwierząt. Dlatego też dermatofity są czynnikami etiologicznymi powierzchownych infekcji grzybiczych, nazywanych dermatomikozami.

Naturalnym rezerwuarem grzybów dermatofitowych są: człowiek, zwierzęta i gleba. Pod względem ekologicznym grzyby te podzielono na 3 grupy – dermatofity bytujące na ludzkiej skórze, włosach czy paznokciach nazywane są antropofilnymi, zoofilne dermatofity z kolei bytują na zwierzętach, natomiast dermatofity geofilne zasiedlają glebę.

Zakażeniu grzybiczemu spowodowanemu przez dermatofity antropofilne towarzyszy zazwyczaj słabo nasilony, chroniczny odczyn zapalny, jednakże w literaturze opisano również przypadki przebiegające z nacieczeniem i ze znacznym odczynem zapalnym. Z kolei dermatomikozy spowodowane przez gatunki zoofilne oraz geofilne u ludzi wywołują zazwyczaj silny odczyn zapalny, który jest wynikiem reakcji ze strony układu immunologicznego gospodarza na antygeny grzybicze. Przebieg schorzenia jest ostry, niekiedy dochodzi do samowyleczenia dzięki eradykacji czynnika patogennego przez układ odpornościowy gospodarza.

Dermatomikozy nazywane są grzybicami właściwymi i należą zarówno do najczęstszych chorób zakaźnych na świecie, jak i do najczęstszych wyleczalnych chorób zakaźnych. Szacuje się, iż rocznie na leki przeciwgrzybicze wydaje się średnio ponad 500 milionów dolarów amerykańskich. Dermatofity mogą wywoływać infekcje skóry gładkiej (tinea corporis), owłosionej (tinea capitis), pachwin (tinea cruris), twarzy (tinea faciei), brody (tinea barbae), dłoni (tinea manuum), stóp (tinea pedis) oraz paznokci (tinea unguium, onychomykoza). Obraz kliniczny zakażenia dermatofitami różni się w zależności od umiejscowienia choroby. Na skórze gładkiej zmiany chorobowe to okrągłe lub owalne ognisko rumieniowe, dobrze odgraniczone od skóry zdrowej, które szerzy się obwodowo z tendencją do znikania w części środkowej. Na skórze owłosionej natomiast w przebiegu zakażenia pojawić się mogą owalne lub okrągłe ogniska wyłysienia o złuszczającej powierzchni, bądź też bolesny guz zapalny lub naciek z licznymi krostami i obfitą treścią ropną, zasychającą w strupy. Z kolei, paznokcie stóp, zakażone dermatofitami, stają się przebarwione i pogrubiałe, pod płytką gromadzą się masy rogowe, bardzo często dochodzi do onycholizy, a z czasem – do całkowitej destrukcji płytki paznokciowej.

Do zakażenia dermatofitami może dochodzić na drodze bezpośredniego kontaktu z chorymi – ludźmi lub zwierzętami domowymi, czy też gospodarskimi, jednakże najczęściej zakażenie odbywa się drogą pośrednią, na przykład poprzez kontakt w miejscach publicznych z elementami zawierającymi grzybnię lub zarodniki, takimi jak złuszczony naskórek oraz włosy. Do zakażenia grzybem dermatofitowym może także dojść w przypadku kontaktu z bezobjawowymi nosicielami – kiedy to zarodniki grzybów bytują u ludzi na skórze i jej przydatkach, lub u zwierząt na futrze, piórach czy sierści, bez wywoływania choroby. W przypadku infekcji grzybami geofilnymi głównym źródłem zakażenia jest gleba – często do rozwoju choroby dochodzi u ogrodników, czy rolników, którzy nie używają rękawic ochronnych w trakcie pracy, w ogródku lub na roli. Jak już wcześniej wspomniano, zakażenia grzybicze wywołane przez dermatofity dotyczą przede wszystkim powierzchownych infekcji – skóry, włosów oraz paznokci. Niezwykle rzadko zdarza się, iż grzyby te wywołują zakażenia układowe, dotyczy to jednak osób z bardzo osłabionym systemem immunologicznym.

Morfologicznie, dermatofity podzielono na trzy rodzaje. Taksonomia ta oparta jest na różnicach w budowie makrokonidiów (makrospor). Wyróżnia się rodzaj Trichophyton, Microsporum oraz Epidermophyton. Podział ten dotyczy fazy rozmnażania bezpłciowego (fazy anamorficznej). Rozróżnienie to zostało wprowadzone zanim odkryto, iż dermatofity zdolne są również do rozmnażania płciowego (faza telemorficzna). Obie z tych faz różnią się zarówno makroskopowo, jak i mikroskopowo, jednakże w praktyce laboratoryjnej obserwuje się wyłącznie fazę niedoskonałą – anamorficzną.

2.Grzyby drożdżopodobne

Grzyby drożdżopodobne są bardzo rozpowszechnione w środowisku i często izolowane są z materiałów bogatych w węglowodany, mogą występować na powierzchni niektórych owoców (na przykład winogron, jabłek czy też brzoskwiń), bądź w wydzielinach roślinnych. Niektóre z gatunków tych grzybów zasiedlają także glebę. W porównaniu z innymi mikroorganizmami, funkcja ekologiczna oraz bioróżnorodność grzybów drożdżopodobnych jest stosunkowo nieznana. Wśród tej dużej grupy mikroorganizmów znajdują się komensale będący naturalnym składnikiem mikrobioty u ludzi dorosłych. Przede wszystkim należy tu wymienić drożdżaki z rodzaju Candida, które występują na skórze, błonach śluzowych układu oddechowego, pokarmowego oraz rozrodczego. Ponadto, grzyby te mogą być czynnikami etiologicznymi zakażeń grzybiczych i powodować infekcje drożdżakowe skóry i jej przydatków (np. wyprzenia), i błon śluzowych (np. kandydoza jamy ustnej). Drożdżaki z rodzaju Candida zajmują również ważne miejsce na liście czynników wywołujących zakażenia szpitalne. Mikroorganizmy te mogą wywoływać ostre i przewlekłe grzybice inwazyjne. Szczególnie są one niebezpieczne dla pacjentów należących do grup ryzyka (między innymi osoby z chorobami nowotworowymi krwi, pacjenci po zabiegach chirurgicznych z cukrzycą, z chorobami w przebiegu których dochodzi do immunosupresji, a także chorzy na przewlekłą obturacyjną chorobę płuc, narkomani, osoby chore na AIDS). Zakażenie może być ograniczone do jednego narządu, wielonarządowe lub też rozsiane. Rokowanie jest złe, a w przypadku nieleczonej narządowej kandydozy może dojść do zgonu pacjenta.

3.Grzyby pleśniowe

Grzyby pleśniowe tworzą bardzo liczną grupę mikroorganizmów. Wśród tysięcy znanych gatunków wyróżnia się, ze względu na bytowanie w różnych temperaturach: drobnoustroje mezofile, psychrofile, termofile, ze względu na sposób odżywiania: saprofity, jak i również ludzkie patogeny. Pleśnie są wszechobecne w środowisku otaczającym człowieka, a ich zarodniki występują powszechnie w kurzu i mogą stanowić zagrożenie dla ludzkiego zdrowia, powodując alergiczne objawy ze strony układu oddechowego (na przykład astma), a także podrażnienie oczu, nosa, gardła, czy zatok. W domach grzyby te można znaleźć w miejscach wilgotnych, ciemnych lub zaparowanych, takich jak na przykład łazienka, kuchnia, piwnica, pomieszczenia o słabej wentylacji.

Niektóre gatunki grzybów pleśniowych produkują mikotoksyny, które mogą stanowić bardzo poważne zagrożenie dla życia i zdrowia ludzi oraz zwierząt. Przeprowadzone badania wskazują, iż ekspozycja na wysokie dawki mikotoksyn może być przyczyną zaburzeń neurologicznych, a nawet śmierci.

Ponadto, pewne z gatunków grzybów pleśniowych są szczególnie niebezpieczne dla pacjentów z grup ryzyka – tych z obniżoną odpornością, gdyż mogą wywoływać grzybice głębokie. Zakażenia takie mają charakter oportunistyczny, a czynniki ryzyka to między innymi neutropenia, deficyt w zakresie odporności komórkowej, niedożywienie, cukrzyca, steroidoterapia, leczenie cytotoksyczne czy też przeszczep szpiku.

Grzyby pleśniowe bardzo rzadko są czynnikami etiologicznymi powierzchownych zakażeń grzybiczych skóry oraz jej przydatków.

CZYTAJ DALEJ

Grzybica paznokci stóp (łac. onychomycosis) jest wywoływana głównie przez tzw. dermatofity bądź grzyby pleśniowe. Przebarwienia, zgrubienia i łamliwość paznokci są objawami grzybicy paznokci, ale również innych chorób skóry i paznokci

CZYTAJ DALEJ

Łupież pstry (łac. pityriasis versicolor) to choroba spowodowana grzybami drożdżopodobnymi. To niezwykle dokuczliwa dolegliwość, ponieważ zakażona skóra swędzi, a jeżeli nie jest odpowiednio leczona, mogą pozostać na niej trwałe ślady infekcji.

CZYTAJ DALEJ

FAQ – czyli najczęściej zadawane pytania. Dowiedz się więcej o grzybicy i jej diagnostyce ;-)

Epidemiologia zakażeń grzybiczych